Funcția autocatalitică a acizilor nucleici se referă la modul în care ADN-ul se reproduce singur, adică procesul de replicare cu mecanism semiconservator și duplicare a informațiilor genetice.
Modelul de replicare a ADN-ului
Când o celulă se divide, este important ca fiecare celulă „fiică” să primească o copie identică a ADN-ului „matern”. Acest lucru se realizează prin procesul de replicare a ADN-ului. Replicarea ADN-ului are loc în timpul fazei S (de sinteză) a ciclului celular, înainte ca celula să intre în mitoză sau meioză[1].
Cunoașterea în detaliu a structurii de elice dublă a ADN-ului ne ajută să înțelegem modul în care acesta este copiat. Ne reamintim regula lui Chargaff care spune că nucleotidele adeninei se împerechează cu cele ale timinei similar modului în care nucleotidele citozinei se împerechează cu cele ale guaninei, adică cele două catene de nucleotide sunt complementare. De exemplu, secvenței de nucleotide AGTCATGA de pe o catenă de ADN îi corespunde secvența de nucleotide TCAGTACT pe catena complementară (Figura 6.1a). Datorită complementarității lor, o catenă se poate recrea pe baza celeilalte catene.
Această proprietate sugerează că cele două catene ale elicei duble se separă sau desfac în timpul replicării iar fiecare catenă servește drept șablon pentru copierea noii catenei complementare (Figura 6.1b). În timpul replicării ADN-ului, fiecare dintre cele două catene care alcătuiesc elicea dublă servește drept șablon pentru copierea catenelor noi. Catena nouă sau „fiică” va fi complementară catenei vechi sau „mamă”. Fiecare catenă dublă nouă constă dintr-o catenă mamă (veche) și o catenă fiică (nouă). Acest proces este cunoscut sub numele de replicare semiconservatoare. Cele două copii noi de ADN au o secvență identică de baze nucleotidice și sunt distribuite în mod egal celor două celule fiice.
Figura 6.1: a) Cele două catene de ADN sunt complementare, ceea ce înseamnă că secvența de baze azotate dintr-o catenă poate fi utilizată pentru a crea succesiunea corectă de baze în cealaltă catenă. b) Modelul semiconservator al replicării ADN-ului: catenele originale de ADN sunt indicate prin culoarea gri iar catena nouă de ADN sintetizat este indicată prin culoarea albastră.
Replicarea ADN-ului în procariote
Replicarea ADN-ului a fost extrem de bine studiată în procariote, în principal din cauza dimensiunilor mici ale genomului lor și a numărului mare de variante disponibile. Bacteria Escherichia coli are un singur cromozom circular cu 4,6 milioane de perechi de baze; acestea se reproduc în aproximativ 42 de minute, plecând de la o singură secvență de origine a replicării și continuând în jurul cromozomului pe ambele direcții. Aceasta înseamnă că se adaugă aproximativ 1.000 de nucleotide pe secundă. În general, procesul de replicare al procariotelor este mult mai rapid decât cel al eucariotelor și nu face prea multe greșeli.
Replicarea ADN-ului este un proces foarte complicat în desfăsurarea căruia mai multe enzime și proteine de structură joacă roluri critice. O jucătoare cheie este enzima ADN–polimerază, cunoscută și sub numele de ADN–pol. Această enzimă are rolul de a adăuga nucleotide, una câte una, catenei de ADN în creștere, care este complementară catenei de ADN șablon. Adăugarea de nucleotide necesită energie, care este obținută de la trifosfații nucleozidici (NTP): ATP, GTP, TTP și CTP. Similar moleculei de ATP, trifosfații nucleozidici sunt molecule cu energie ridicată care pot servi ca sursă de energie atât pentru nucleotidele de ADN, cât și pentru reacțiile de polimerizare. Energia eliberată prin „ruperea” legăturilor dintre fosfați este utilizată pentru formarea unei legături fosfodiesterice între nucleotida de intrare și catena în creștere.
În prezent se cunosc trei tipuri principale de polimeraze implicate in replicarea procariotă: ADN–pol I, ADN–pol II și ADN–pol III. ADN–pol I este o enzimă accesorie importantă în replicarea ADN-ului care, împreună cu ADN–pol II, este implicată mai ales în repararea acestuia. ADN–pol III este enzima de bază pentru sinteza ADN-ului.
Cum știe mecanismul de replicare de unde să înceapă? Se pare că există niște secvențe specifice de nucleotide, numite origini ale replicării, de unde poate începe replicarea. Astfel, bacteria E. coli, la fel ca majoritatea procariotelor, are o singură secvență de origine a replicării pe singurul ei cromozom; secvența are o lungime de aproximativ 245 de perechi de baze și este bogată în secvențe de nucleotide AT.
Există anumite proteine care recunosc secvența de origine a replicării și se pot lega de ea. O enzimă numită helicază desface spirala dublă de ADN prin ruperea legăturilor de hidrogen dintre perechile de baze azotate. Acest proces are nevoie de energia suplimentară produsă de hidroliza unei molecule de ATP.
O dată cu despiralizarea ADN-ului se formează două structuri în formă de Y numite furci de replicare. Furcile de replicare se formează la originea replicării și se extind bidirecțional, pe măsură ce aceasta avansează. În apropierea furcii de replicare acționează niște proteine de legătură cu ADN–ul monocatenar care acoperă catenele separate de ADN pentru a preveni ADN-ul monocatenar să se întoarcă înapoi în elicea dublă (adică să redevină bicatenar).
ADN–pol are două restricții importante:
1. Este capabilă să adauge nucleotide numai în direcția 5′ spre 3′. Aceasta înseamnă că o catenă nouă de ADN poate fi extinsă doar în această direcție.
2. Necesită o grupare hidroxil (-OH) liberă la capătul 3′ pentru a putea adăuga o nucleotidă prin formarea unei legături fosfodiesterice între gruparea hidroxil de la capătul 3′ și radicalul fosfat de la capătul 5′ al nucleotidei următoare. Aceasta înseamnă, în esență, că nu poate adăuga o nucleotidă dacă la capătul 3′ nu este disponibilă o grupare hidroxil liberă. Atunci cum adaugă ADN–pol prima nucleotidă?
Problema este rezolvată cu ajutorul unui primer care furnizează o grupare hidroxil (-OH) liberă la capătul 3′. O altă enzimă, ARN–primaza, sintetizează un segment de ARN lung de aproximativ cinci până la zece nucleotide, care este complementar șablonului de ADN. Deoarece această sinteză precede sinteza ADN-ului, produsul care rezultă în urma ei este numit sugestiv primer. Apoi ADN–pol extinde acest primer de ARN, adăugându-i, una câte una, nucleotide de ADN complementare cu catena șablon.
Pe durata replicării, furca de replicare se deplasează cu o viteză de 1.000 de nucleotide pe secundă. Pe măsură ce elicea dublă de ADN se deschide, enzima topoizomerază previne supraspiralizarea sau supraînfășurarea acesteia în fața furcii de replicare. Topoizomeraza face acest lucru prin producerea unor ciobituri temporare în elicea de ADN iar apoi prin sigilarea lor. Deoarece ADN–pol se poate extinde doar în direcția 5′ spre 3′ și deoarece elicea dublă de ADN este antiparalelă, la furca de replicare apare o mică problemă: cele două catene șablon au orientări opuse, adică o catenă este orientată pe direcția 5′ spre 3′ iar cealaltă este orientată pe direcția 3′ spre 5′.
Catena nouă de ADN, care este complementară catenei de ADN parental de pe direcția 3′ spre 5′, poate fi sintetizată continuu înspre furca de replicare. Această catenă este cunoscută sub numele de catenă principală. Cealaltă catenă, complementară ADN-ului parental de pe direcția 5′ spre 3′, este extinsă dinspre furca de replicare cu ajutorul unor bucăți scurte de ADN cunoscute sub numele de fragmente Okazaki. Fiecare fragment Okazaki necesită un primer pentru a putea începe sinteza. Aceste primere noi sunt așezate pe direcția furcii de replicare în sensul dinspre aceasta. Catena cu fragmente Okazaki este cunoscută sub numele de catenă întârziată. Catena principală poate fi extinsă cu un singur primer, în timp ce catena întârziată are nevoie de câte un primer pentru fiecare fragment Okazaki. Direcția generală de extindere a catenei întârziate este de la 5′ spre 3′ iar cea a catenei principale de la 3′ spre 5′.
O proteină în formă de inel numită proteină cu clemă glisantă are rolul de a ține ADN–pol pe loc în timp ce aceasta adaugă nucleotide. Pentru a-și îndeplini sarcina, proteina cu clemă glisantă se atașează de ADN. Pe măsură ce sinteza avansează, primerii de ARN sunt înlocuiți cu nucleotide de ADN. Primerii de ARN sunt îndepărtați prin activitatea de exonuclează a enzimei ADN–pol I; aceasta folosește ADN-ul din spatele ARN-ului ca primer propriu și umple golurile lăsate de îndepărtarea nucleotidelor de ARN la adăugarea de nucleotide de ADN. Ciobiturile sau golurile care rămân între ADN-ul nou sintetizat (cel care a înlocuit primerul de ARN) și ADN-ul sintetizat anterior sunt sigilate de enzima ADN–ligază, care catalizează reacțiile de formare a legăturilor fosfodiesterice dintre capătul 3′ (-OH) al unei nucleotide și capătul 5′ (radical fosfat) al nucleotidei următoare.
Odată ce cromozomul a fost complet reprodus, cele două copii ale ADN-ului se plasează în cele două celule rezultate din diviziunea celulară.
Procesul de replicare a ADN-ului (Figura 6.2) poate fi rezumat astfel:
- ADN-ul se despiralizează în jurul unei secvențe de origine a replicării.
- Helicaza deschide furcile de replicare care, în continuare, se vor extinde bidirecțional.
- Proteinele de legătură cu ADN–ul monocatenar acoperă catenele separate de ADN din jurul furcii de replicare pentru a preveni ADN-ul monocatenar să se întoarcă în elicea dublă.
- Topoizomeraza se leagă de regiunea din fața furcii de replicare pentru a preveni supraînfășurarea.
- Primaza sintetizează primeri de ARN care sunt complementari catenei de ADN.
- ADN–pol III începe să adauge nucleotide la capătul capătul 3′ (-OH) al primerului.
- Ambele catene, principală și întârziată, continuă să se alungească.
- Primerii de ARN sunt îndepărtați prin activitatea de exonuclează.
- Golurile rămase sunt umplute de ADN–pol I.
- Decalajul dintre fragmentele Okazaki este sigilat cu ADN–ligază, care catalizează reacțiile de formare a legăturilor fosfodiesterice.
Figura 6.2: O furcă de replicare se formează prin deschiderea originii replicării și separarea catenelor de ADN de către helicază. Un primer de ARN este sintetizat și alungit de enzima ADN-pol. Pe catena principală ADN-ul este sintetizat continuu, în timp ce pe catena întârziată ADN-ul este sintetizat pe porțiuni scurte. La final fragmentele de ADN sunt unite prin enzima ADN-ligază (neprezentată).
| Enzimă sau proteină | Funcție specifică |
|---|---|
| ADN–pol I | Polimeraza care îndepărtează primerul de ARN și îl înlocuiește cu ADN nou sintetizat. |
| ADN–pol III | Polimeraza principală care adaugă nucleotide noi de ADN pe direcția 5′ – 3′. |
| Helicază | Desface elicea dublă de ADN prin ruperea legăturilor de hidrogen dintre bazele azotate. |
| Ligază | Unește golurile dintre fragmentele Okazaki și creează o catenă continuă de ADN. |
| Primază | Sintetizează primerii de ARN necesari pentru a începe replicarea. |
| Proteină cu clemă glisantă | Ține ADN–pol pe loc în timp ce aceasta adaugă nucleotide. |
| Topoizomerază | Previne supraspiralizarea elicei de ADN în fața furcii de replicare prin producerea unor ciobituri temporare în aceasta și apoi sigilarea lor. |
| Proteine de legătură cu ADN-ul monocatenar (SSB) | Acoperă catenele separate de ADN pentru a preveni ADN-ul monocatenar să se întoarcă înapoi în elicea dublă. |
Tabel 6.1: Un rezumat al enzimelor și proteinelor implicate în replicarea ADN-ului la procariote și funcțiile îndeplinite de acestea.
Replicarea ADN-ului în eucariote
Genomurile eucariote sunt mult mai mari și mai complexe decât genomurile procariote. În plus, eucariotele au mai mulți cromozomi liniari diferiți între ei. Genomul uman are 3 miliarde de perechi de baze într-un set de cromozomi haploid și în timpul fazei S a ciclului celular sunt reproduse 6 miliarde de perechi de baze.
Replicarea eucariotă are aceleași etape ca replicarea procariotă – inițiere, alungire și terminare – dar este mult mai lentă decât aceasta. Rata de replicare eucariotă este de aproximativ 100 de nucleotide pe secundă. Fiecare cromozom eucariot are mai multe secvențe de origine a replicării. Astfel, la nivelul întregului genom, oamenii pot avea până la 100.000 de origini ale replicării. Ciuperca Saccharomyces cerevisiae (în engleză yeast), care este un organism eucariot, are pe cromozomii săi niște secvențe speciale cunoscute sub numele de secvențe de replicare autonomă (ARS). Secvențele ARS sunt echivalente cu secvențele de origine a replicării ale bacteriei E. coli.
Eucariotele au mai multe enzime de tipul ADN-polimerază decât procariotele. În prezent sunt cunoscute paisprezece asemenea enzime, dintre care cinci au fost bine studiate și se știe că au roluri majore în timpul replicării. Ele sunt cunoscute sub numele de pol α, pol β, pol γ, pol δ și pol ε.
Pentru a putea începe, replicarea eucariotă are nevoie de un șablon de ADN disponibil. Ne reamintim că ADN-ul eucariot este înfășurat strâns în jurul nucleelor proteinelor numite histone formând structurile numite nucleozomi. Replicarea eucariotă începe cu îndepărtarea și înlocuirea histonelor, ceea ce explică rata de replicare mai scăzută a acestora față de procariote. Cromatina – complexul proteine-cromozomi derulați – poate suferi unele modificări chimice în urma cărora o macromoleculă de ADN poate aluneca de pe o proteină și deveni accesibilă enzimelor implicate în replicare. Apoi, la originea replicării se formează un complex proteic de pre-replicare alcătuit din niște proteine inițiatoare, altele decât proteinele obișnuite implicate în replicare. După acest pas sunt recrutate enzima helicază și proteinele necesare replicării (Tabel 6.2).
Helicaza este o enzimă care despiralizează elicea dublă de ADN cu ajutorul energiei degajate de hidroliza unei molecule de ATP. Despiralizarea este necesară pentru a expune bazele celor două catene astfel încât ele să fie recunoscute de noile baze, cu care urmează să formeze perechi complementare. Sinteza ADN-ului decurge bidirecţional: la fiecare origine a replicării se formează două furci de replicare în direcţii opuse faţă de aceasta. Deschiderea elicei duble de ADN poate cauza supraînfășurarea (supraspiralizarea) acestuia în fața furcii de replicare, situație care este rezolvată de enzima topoizomerază. Apoi, enzima primază formează primerii de ARN, cu ajutorul cărora enzimele ADN-pol pot începe sinteza.
În replicarea eucariotă propriu-zisă sunt implicate trei ADN–polimeraze majore (α, δ și ε). Enzima ADN–pol α adaugă un fragment scurt (20-30 nucleotide) de ADN la primerul de ARN de pe ambele catene apoi predă sarcina de lucru altei polimeraze. Enzima ADN–pol ε sintetizează catena principală în mod continuu. Enzima ADN–pol δ sintetizează catena întârziată din niște bucăți de ADN scurte numite fragmente Okazaki. O proteină cu clemă glisantă cunoscută sub numele de PCNA (antigen nuclear celular proliferant) stabilizează enzima ADN–pol pentru a nu aluneca de pe ADN.
Pe măsură ce ADN–pol δ intră în primerul de ARN de pe catena întârziată, îl deplasează din șablonul de ADN. Primerul de ARN deplasat este apoi îndepărtat de către enzima RNaza H (endonuclează cu clapă) și înlocuit cu nucleotide de ADN. Fragmentele Okazaki din catena întârziată sunt unite după ce primerii de ARN au fost înlocuiți cu ADN. Apoi golurile dintre fragmente sunt sigilate cu ADN–ligază prin formarea unor legături fosfodiesterice.
| Proprietate | Procariote | Eucariote |
|---|---|---|
| Origine a replicării | una | mai multe |
| Rata de replicare | 1000 nucleotide/s | 50 – 100 nucleotide/s |
| Tipuri de ADN-pol | 5 | 14 |
| Telomerază | absentă | prezentă |
| Înlocuirea primerului de ARN | ADN–pol I | RNase H |
| Întinderea catenei | ADN–pol III | ADN–pol α, ADN–pol δ, ADN–pol ε |
| Proteină cu clemă glisantă | prezentă | PCNA |
Tabel 6.2: Diferențele dintre replicarea procariotă și cea eucariotă.